Actividad enzimática de la αamilasa (página 2)

Parte 1

–pH salival:
entre 7 y 8

–Tiempo de
referencia: desapareció el color azul a los
5" 30"" de agregar la enzima a la dilución de 1/50 y se
obtuvo un color pardo. Como este tiempo de referencia se obtuvo
en el rango propuesto por el TP de entre 2 y 8 minutos, podemos
afirmar que la dilución 1/50 es la óptima.

Parte 2

Dilución 1/100 NaCl con saliva: se observó una
desaparición del color azul en el tubo 13 a los 6" 30"" de
agregar la solución al tubo de almidón a 37° C.
En el tubo control, luego de
17 tubos (pasados 8" 30""), no se apreciaron cambios (el color
azul no desapareció), es decir, no hubo efecto
acromático.

Esto quiere decir que en presencia de NaCl la actividad
enzimática de la ααamilasa aumenta ya que
necesita un tiempo menor al del control para lograr el efecto
acromático. Se podría suponer que Na+ o
Cl"  o ambos pueden afectar la acción
enzimática de ααamilasa.

Discusión:

Para empezar, se ha de aclarar que las diluciones
óptimas para salivas de diferentes personas son distintas
porque las características y concentraciones de los
compuestos varían de una persona a otra.
Esto mismo ocurre con el pH salival y el tiempo de
referencia.

El rango de 2 a 8 minutos para el efecto acromático
elegido se debe a que los tiempos sean manejables en el trabajo
práctico. Si se buscase un tiempo de referencia muy
pequeño, los cambios no hubiesen sido apreciados.

Por los experimentos que
realizamos en el TP, no se puede conocer la forma en que el NaCl
aumenta la actividad de la enzima, sin embargo, una vez
finalizado el TP, nos informaron que recientes descubrimientos
dieron a conocer que la a-amilasa contiene en los restos
aminoacídicos de su sitio activo Cl–, y por
ello, al agregar NaCl, los aniones cloruro se unen al sitio
activo aumentando la actividad enzimática. Es decir, el
cloro actúa como cofactor de la enzima.

La proteinasa K es una proteasa, es decir, tiene una
actividad específica la cual consiste en degradar proteínas.
La misma actúa rompiendo los enlaces débiles del
polipéptido, hasta que adquiera su estructura
primaria y, por lo tanto, pierda su funcionalidad.

La proteinasa K (100 µgl, disuelta en una
solución acuosa con buffer) se incuba con la
dilución de saliva (1 ml) durante 1h. a 50 grados Celsius
(todo este proceso es el
pre-tratamiento de la dilución). Luego de este lapso de
tiempo se agrega la saliva tratada con proteinasa a los 10 ml de
almidón y se repite el procedimiento
para la determinación de la actividad enzimática
realizado en la Parte 1.

Al ser la ααamilasa una proteína, uno
esperaría que la proteinasa le haga perder su
funcionalidad. Sin embargo, esto no ocurrió, puesto que
luego de un determinado período de tiempo se
observó el efecto acromático, es decir, la
ααamilasaestaba actuando. Esto se puede explicar de
diversas maneras. Por ejemplo, nunca averiguamos la
concentración de la enzima en la saliva, por lo tanto, tal
vez era muy superior a la de la proteinasa y por eso no
llegó a cumplir se función.
De la misma manera, hay que tener en cuenta el período de
incubación. Tal vez no fue suficiente para que la
proteinasa k degrade a la ααamilasa.

Por último, cabe aclarar que se efectuó un
controlo de reacción para no concluir erróneamente.
Se colocó en un tubo una dilución de saliva pero
son sólo el buffer, para asegurarnos que no haya agentes
externos que afecten los resultados.

En el pre-tratamiento de la enzima a
una temperatura de
100 º C  durante 10 minutos se trató
previamente a la dilución optima de saliva 1/50 durante 7
minutos en un baño de agua a
100º C, pero al medir la actividad enzimática,
con  el mismo procedimiento descrito en  la parte 1, no
se observó ningún cambio del
color azul, (por lo que se puede decir que no se produjo el
efecto acromático), durante 7 minutos ( que es el tiempo
de referencia obtenido por el grupo 2 con pH
salival entre 7 y 8). A partir de los resultados obtenidos se
podría deducir que la alfaa-amilasa se
desnaturaliza al ser expuesta a una temperatura tan elevada, ya
que se produce un exceso de choques entre las moléculas
presentes en la saliva como consecuencia del aumento de la
energía cinética,  produciendo la ruptura de
las uniones débiles (como puentes de hidrogeno,
fuerzas de van der waals, interacciones iónicas), que
afecta la estructura terciaria de la enzima y a su vez la
conformación de su sitio activo, perdiendo la capacidad de
romper las uniones C1-C4 de las glucosas. Y es por esto que el
color azul no desaparece en los tubos de ensayo.

Con respecto a la influencia del pH del medio en la
actividad enzimática de la a-amilasa,
podemos decir que a pH extremos (es decir, muy ácidos o
muy básicos) la enzima no funciona, o al menos disminuye
notablemente su actividad. Esto podemos concluir a partir de los
experimentos realizados por otros grupos, que,
manteniendo el resto de las condiciones iniciales, midieron la
actividad de la a-amilasa en dos medios con pH
extremos.

El grupo 4 había encontrado un tiempo de referencia de
6 minutos (aparición del efecto acromático) para su
dilución óptima y un pH salival de entre 6 y 7. Sin
embargo, a un pH 2 (más ácido), no encontró
cambios (es decir, no hubo efecto acromático) en 10
minutos de reacción. Algo parecido ocurrió con el
grupo 12, que había encontrado un tiempo de referencia de
1" 30"" para un pH salival de entre 7 y 8, y cuando
repitió el experimento en un medio con pH 12 (más
básico) no hubo efecto acromático en 4 minutos de
reacción.

Todas las enzimas tienen un
pH óptimo, en donde tienen mayor actividad, y a medida que
se alejan de ese pH (para ambos lados) disminuyen su actividad.
Esto se debe a que algunos restos aminoacídicos de las
enzimas (en el caso de que sean proteínas) tienen cargas y
pueden ser los responsables tanto de mantener la estructura
tridimensional de la proteína como de interaccionar con el
sustrato. El pH del medio (es decir, la presencia de iones
H+ u OH-) puede modificar las cargas de
estos aminoácidos y de este modo incluso desnaturalizar a
la enzima.

Debemos aclarar que aunque la enzima tenga actividad al pH
salival de cada persona (siempre entre 6 y 8, según la
tabla), esto no quiere decir que éste sea su pH
óptimo. Para determinarlo experimentalmente,
deberíamos haber medido la actividad enzimática a
diferentes pH para realizar una curva, pero no podemos determinar
el pH óptimo de la a-amilasa a partir de los resultados de
este TP.

En el tratamiento del efecto de la
temperatura, se mide la actividad enzimática como se
efectuó en la parte 1, pero incubando la reacción a
temperaturas diferentes de 37° C: a 0° C, a temperatura
ambiente y a
70° C.

A 0° C y a 70° C, no se
presentaron cambios de color en los tubos de la gradilla, es
decir que el color azul nunca desapareció. Por lo tanto,
se podría decir que la ααamilasa no
actuó. En cambio, a temperatura ambiente sí se
presentaron cambios, pero en un tiempo mayor al de referencia del
grupo que lo realizó. Esto era de esperarse, ya que cada
enzima tiene un rango de temperatura óptima y, en el caso
de la ααamilasa, al encontrarse ésta en el
cuerpo humano
(que siempre tiene una temperatura de 37° C), se supone que a
temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero sí
disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser
menores.

Sin embargo, al disminuir demasiado la temperatura, los
choques entre las moléculas disminuyen también, por
lo que la actividad enzimática baja hasta el punto en el
que no se puede ver en el experimento. Por el contrario, al
aumentar la temperatura de incubación a 70° C, los
choques entre las moléculas se van a acrecentar de tal
forma que la enzima se va a desnaturalizar. Es por ello que se
presume que no se observaron cambios en los tubos.

Autor:

Agustín Garrido